جداسازی، همسانه سازی و بیان هترولوگ سه ژن کد کننده ی تیوردوکسین نوع h ( ostrxh20، ostrxh1 و ostrxh23) از گیاه برنج oryza sativa

تیوردوکسین ها ( trxs) پروتئین های کوچکی با وزن مولکولی kda 14-12 هستند که در تمام پروکاریوت ها و یوکاریوت ها یافت می شوند. این پروتئین ها با داشتن یک گروه تیول – دی سولفید در جایگاه فعالشان (wcg/ppc)، در احیاء برگشت پذیر پیوند های دی سولفیدی نقش دارند. ایزوفرم های مختلفی از trx در گیاهان وجود دارد. ایزوفرم های f، m، x و y در کلروپلاست، trx o در میتوکندری و نوع h در سیتوزول، یافت می شوند. trxh دارای اهمیت اساسی در رشد و نمو گیاه است. در سیتوزول، الکترون ها توسط تیوردوکسین ردوکتاز وابسته به nadph (ntr)، از nadph به trxh منتقل می شوند. در ژنوم برنج، 30 جایگاه ژنی با 54 مدل ژنی برای trx وجود دارد. از این میان، 9 ژن، کد کننده ی trxh می باشد. علی رغم تحقیقات زیادی که بر روی سیستم ntr/trxh در گیاهان صورت گرفته است، وظیفه و عملکرد هر ایزوفرم به طور اختصاصی مشخص نمی باشد. در تحقیق حاضر، توالی ژن کد کننده ی ایزوفرم ostrxh23، با استفاده از روش rt-pcr، از اندام هوایی گیاهچه های 7 روزه ی برنج oryza sativa رقم l2 ( 7 روز پس از جوانه زنی بذر)، جداسازی و سپس در پلاسمید خطی pjet، همسانه سازی شد. جهت تولید پروتئین نوترکیب، این ژن در پلاسمید بیانی pet-15b، که دارای پروموتر t7 و ناحیه ی کد کننده ی his-tag بود، همسانه سازی شد. پلاسمید بیانی نوترکیب حاصل، به سویه ی مناسبی از باکتری escherichia coli به نام rosetta (de3) منتقل شد. با تحریک پروموتر t7 به وسیله ی iptg، میزان مناسبی از پروتئین نوترکیب his6-ostrxh23 تولید گردید. از طرفی، ژن های کد کننده ی ایزوفرم های ostrxh1 و ostrxh20، که قبلا" در پلاسمید puc57، همسانه سازی شده بودند نیز در پلاسمید بیانی pet-15b مورد همسانه سازی قرار گرفته و پس از انتقال به سویه ی rosetta (de3)، شکل نوترکیب پروتئین های his6-ostrxh1 و his6-ostrxh20 نیز تولید گردید. با استفاده از روش کروماتوگرافی جذبی، سه پروتئین الحاقی حاصله خالص سازی شدند و خصوصیات شیمیایی و کینتیکی آن ها مقایسه شد. جهت بررسی فعالیت کینتیکی پروتئین های نوترکیب تولید شده، از انسولین به عنوان سوبسترای عمومی trx و همچنین dtt به عنوان عامل احیا کننده استفاده شد. سپس با استفاده از برنامه ی excel، نمودار جذب نور در a650بر حسب زمان رسم و شیب خط محاسبه شد. نتایج نشان داد، هر سه ایزوفرم نوترکیب تولید شده، فعال بودند، به طوریکه در مقایسه با نمونه ی شاهد، جذب نور در a650، افزایش پیدا کرد. در بین سه ایزوفرم مورد مطالعه، ostrxh23 با a650/min معادل 0588/0 دارای بیشترین فعالیت و ostrxh1 با a650/min معادل 022/0، دارای کمترین میزان فعالیت بود. با توجه به اینکه در انتهای آمین ostrxh20، دو اسید آمینه ی سیستئین و در انتهای آمین ostrxh1 و ostrxh23، یک سیستئین وجود داشت، وجود این سیستئین ها در محلی غیر از جایگاه فعال، احتمال اینکه، بعضی از مولکول های این سه ایزوفرم، با استفاده از پیوند های دی سولفیدی، به شکل دایمر و برخی دیگر به شکل مونومر باشند را تقویت کرد که الکتروفورز نمونه ها بر روی ژل sds-page در شرایط عدم حضور dtt این مطلب را تایید نمود. همچنین تجزیه و تحلیل درخت فیلوژنتیک ترسیم شده برای ایزوفرم های مختلف trxh در گیاهان مختلف نشان داد که ایزوفرم ostrxh23 در حالیکه با ایزوفرم های ostrxh1 و ostrxh20، دارای 37 درصد شباهت در توالی است، اما با ایزوفرم tatrxh3 از گیاه گندم و hvtrxh1 از گیاه جو دارای قرابت بسیار بیشتری، یعنی 73 تا 76 درصد، شباهت در توالی است. ostrxh1 دارای شباهتی در حدود 80 درصد با lctrxh، گیاهی از جنس چاودار وحشی بود. وجود تفاوت های مشاهده شده در توالی ها و همچنین آزمایش های صورت گرفته در محیط in vitro، می تواند نشان دهنده ی عملکرد های متفاوت این تیوردوکسین ها در سیستم گیاهی باشد. کلمات کلیدی: برنج، تیوردوکسین، همسانه سازی، بیان ژن، کروماتوگرافی جذبی، فعالیت کینتیکی، درخت فیلوژنتیک